Arch Soc Esp Oftalmol. 2007 Jun ;82 (6):377-80 17573650 (P,S,E,B) [Response to idebenone and multivitamin therapy in Leber's hereditary optic neuropathy]
[My paper] N Barnils, E Mesa, S Muñoz, A Ferrer-Artola, J Arruga
Hospital Universitario de Bellvitge, L'Hospitalet de Llobregat, Barcelona, España. noebg76@hotmail.com
OBJECTIVE: To ascertain the efficacy of idebenone and multivitamin treatment in Leber's hereditary optic neuropathy (LHON).
METHOD: Two patients diagnosed of unilateral LHON were treated with megadoses of idebenone, vitamin C and riboflavin for one year. They were examined clinically before, during and after treatment.
RESULTS: No improvement of visual function was observed. Despite the idebenone treatment, in both cases the second eye became involved.
CONCLUSIONS:Despite previous reports of visual recovery with idebenone in patients with LHON, our experience shows that an effective treatment for Leber's disease remains to be found.
Mesh-terms: Adult; Antioxidants :: therapeutic use; Ascorbic Acid :: therapeutic use; Benzoquinones :: therapeutic use; Female; Humans; Male; Optic Atrophy, Hereditary, Leber :: drug therapy; Riboflavin :: therapeutic use; Treatment Failure; Vitamin B Complex :: therapeutic use; Vitamins :: therapeutic use;
domingo, 31 de agosto de 2008
Análisis de 6 mutaciones Leber
Análisis de 6 mutaciones Leber en 31 individuos con atrofia óptica. Estudio de su transmisión en 5 familias
Por Montserrat Gómez Zaera a, Antoni Barrientosa a, Luis Arias b, Isabel Rojas a, Jordi Arruga b, Xavier Estivill a, Jordi Casademont c, Virginia Nunes a
a Centre de Genètica Mèdica i Molecular. IRO. Hospital Duran i Reynals. Barcelona.
b Servei d'Oftalmologia. Hospital de Bellvitge.
c Grup d'Investigació Muscular. Servei de Medicina Interna General. Hospital Clínic. Universitat de Barcelona.
Fundamento:
La atrofia óptica de Leber (AOL) es una enfermedad de origen mitocondrial. Representa la causa más frecuente de incapacidad visual en varones jóvenes que no presentan otra enfermedad. Pacientes y métodos:Se han analizado mutaciones Leber en 31 individuos españoles aquejados de atrofia óptica que cumplen los criterios clínicos de AOL. Se han estudiado las 3 mutaciones primarias y algunas secundarias, y se han comparado sus frecuencias con las de otras series mundiales. También se ha analizado la segregación de la enfermedad y las mutaciones asociadas a ella en cinco grupos familiares. La detección de las mutaciones puntuales se ha efectuado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), seguida de digestión con enzimas de restricción y posterior separación electroforética.
Resultados:
El 67,75% de los pacientes no presenta ninguna de las mutaciones analizadas, el 16,13% presenta una, y el restante 16,13% tiene dos mutaciones Leber. Las tres mutaciones primarias y la 15257 son las que se han detectado en una mayor frecuencia (30% cada una). No existen diferencias estadísticamente significativas entre las tasas de mutaciones primarias de los pacientes de esta serie y los de otras poblaciones. Las diferencias son significativas para la mutación 15257. Conclusiones:La muestra de la población española estudiada no se diferencia de otras poblaciones caucásicas en lo que respecta a las principales mutaciones Leber. La transmisión de dichas mutaciones a la descendencia no implica la transmisión de la enfermedad, lo que dificulta el consejo genético y hace prácticamente inviable el diagnóstico prenatal para esta enfermedad
Med Clin (Barc). 1999;112:326-9.
La atrofia óptica de Leber, también conocida como LHON (Leber's hereditary optic neuropathy), es una enfermedad hereditaria, de transmisión materna, que se presenta normalmente en la segunda o tercera décadas de la vida como una pérdida de visión central de la retina indolora, aguda o subaguda. La afectación de ambos ojos ocurre de forma simultánea o sucesiva. Es la causa más frecuente de incapacidad visual en varones jóvenes del mundo occidental que no presentan otras enfermedades1. En la población de origen caucásico predomina la afectación en los varones (relación varón:mujer = 4:1)2.
La LHON fue la primera enfermedad que pudo asociarse a mutaciones puntuales en el ADN mitocondrial (ADNmt)3. Las mitocondrias contienen 2-10 moléculas de ADN, y en una misma mitocondria pueden coexistir moléculas de ADN normales y mutadas (heteroplasmia), en contraposición a la situación de homoplasmia, en la que existe una sola población de genomas mitocondriales.
Las mutaciones LHON se clasifican en primarias y secundarias. Las primarias (G11778A, G3460A y T14484C) son causa suficiente para provocar LHON por sí mismas y no se detectan en controles normales. Las secundarias, presentes también en controles normales4, aparecen junto con otras mutaciones primarias o secundarias, y se asume que actuarían sinergísticamente en el desarrollo de la enfermedad.
En el presente trabajo se resume nuestra experiencia en el diagnóstico de la atrofia óptica de Leber en la población española. Se describen las mutaciones presentes en 31 individuos independientes estudiados, se compara su frecuencia con otras series europeas o mundiales, y se analiza la segregación de la enfermedad y de las mutaciones asociadas a ella en cinco genealogías. Finalmente, se discute el interés del análisis molecular para establecer el diagnóstico diferencial con otras entidades causantes de pérdida de visión, tales como las neuropatías ópticas dominantes5, isquémica anterior6, tóxicas o desmielinizantes.
Pacientes y métodos
Pacientes
Se seleccionaron individuos que acudieron a la Consulta de Oftalmología del Hospital de Bellvitge y que presentaban las siguientes características: a) pérdida de visión central indolora, aguda o subaguda; b) afectación bilateral de forma simultánea o secuencial, y c) existencia de telangiectasias peripapilares y discreto borramiento e hiperemia del disco óptico en fases iniciales con evolución hacia la atrofia óptica.
De todos los pacientes se obtuvo una historia clínica detallada que incluyó antecedentes familiares, hábitos tóxicos y un examen oftalmológico completo al que se añadieron el test cromático de Ishihara y una campimetría computarizada. Adicionalmente, se realizaron unos potenciales evocados visuales y una resonancia magnética (RM) cerebral.
Métodos
Se procedió a la extracción de ADN total a partir de 15 ml de sangre periférica, siguiendo procedimientos estándar basados en una purificación con fenol-cloroformo y en una precipitación con etanol. El ADN se cuantificó por espectrofotometría registrando la absorbancia a 260 nm. Mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se amplificaron regiones del ADNmt que incluían la posición nucleotídica de las mutaciones a estudiar. Se analizaron las mutaciones primarias 11778, 3460 y 14484, todas ellas localizadas en la región que codifica para la subunidad 1 del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial (CRM), responsables de más del 90% de los casos de atrofia óptica de Leber descritos7. También se incluyó en nuestro trabajo la mutación 15257, localizada en el gen citocromo b, inicialmente considerada primaria8, y más recientemente intermedia (de más importancia clínica que las secundarias) o incluso secundaria7. Finalmente se analizaron las secundarias 15812 en el gen del citocromo b2 y la 4732, localizada en el gen de la sub-unidad 2 del complejo I9. Para cada una de las reacciones de amplificación se utilizaron 200 ng de ADN, la pareja de oligonucleótidos adecuada (tabla 1) a una concentración final de 0,8 µ M y 200 µ M de dNTPs (desoxinucleótidos fosfato). El resto de componentes los proporcionó el kit de PCR de Boehringer-Mannheim: 1,5 U de Taq-ADN polimerasa, 10 mM de Tris-HCl, 1,5 mM de MgCl2 y 50 mM de KCl. Tras las amplificaciones se procedió a la digestión de los productos de PCR con enzimas de restricción para determinar, dependiendo de cada mutación, la ganancia o pérdida de dianas específicas que producen polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Así, cuando una de estas mutaciones ocurre, se produce un cambio en una diana de restricción: bien desapareciendo una existente en el ADNmt salvaje, bien apareciendo una nueva. La tabla 1 ilustra la zona amplificada para cada mutación, la enzima utilizada y los fragmentos esperados tras la digestión. Dichos fragmentos se separaron electroforéticamente en geles de acrilamida al 5% y se tiñeron en bromuro de etidio para su posterior visualización bajo luz ultravioleta.
Para comparar la proporción de cada una de las mutaciones halladas en nuestros pacientes con la descrita en la bibliografía, se utilizó una prueba basada en el cálculo exacto de significación según la ley binomial10 del paquete estadístico SPSS.
Resultados
Inicialmente, se obtuvieron linfocitos de la sangre periférica de 31 individuos independientes. Para cinco de éstos se pudo disponer de sangre de familiares directos, lo que permitió un estudio más completo de la transmisión de las mutaciones Leber en la familia. Todos los individuos que cumplían los criterios clínicos de LHON y para los que se descartó otra enfermedad que justificase la pérdida de agudeza visual fueron incluidos en el presente estudio genético. El total de muestras analizadas, sumando los familiares disponibles, fue de 49. El rango de edad de los pacientes abarcaba de los 14 a los 55 años y el 78% eran varones. El período de evolución de la pérdida de visión en el momento del diagnóstico oscilaba entre las 3 semanas y los 12 meses. La agudeza visual de los pacientes en la primera visita variaba desde la percepción de luz hasta 0,4 según la escala de Wecker, y todos ellos mostraron un test cromático alterado. El campo visual presentó un escotoma central o centrocecal y los potenciales evocados visuales evidenciaron un retraso en el tiempo de latencia y una disminución en la amplitud de las ondas en todos los casos. La RM fue normal también en todos ellos, excepto en uno en el que al aplicar secuencias de supresión de grasa se detectó un aumento de señal en ambos nervios ópticos.
En la figura 1, se puede observar el fondo de ojo característico de un paciente con LHON (III2 de la familia 2; fig. 2).
La distribución de las mutaciones Leber en el grupo estudiado es la siguiente: en 21 personas (67,75%) no se halló ninguna de las mutaciones analizadas; cinco (16,13%) presentaban una única mutación, y otras cinco, dos mutaciones en su ADNmt (tabla 2).
Al comparar la tasa de mutaciones primarias en nuestros pacientes con las de otros estudios en la población con mutaciones Leber no española, observamos pocas diferencias: entre nuestra población se da en una menor frecuencia la mutación 11778 (el 30% frente a más de un 50%, p = 0,34, NS)11, mientras que la frecuencia de las otras mutaciones primarias es muy parecida (el 30% de la mutación 3460 frente a un 20-25%, p = 0,47, NS, y el 30% de la 14484, frente a algo menos del 20%, p = 0,32, NS)11,12. Por el contrario, la proporción de nuestros pacientes con la mutación 15257 (30%) prácticamente dobla la observada en otros países (alrededor del 15%, p = 0,0004)12.
Grupos familiares estudiados
En 3 de las 5 familias disponibles se detectó alguna mutación Leber. Las genealogías de estas 3 familias se detallan en la figura 2, junto con las mutaciones presentes en el ADNmt de cada individuo. En la familia 1, se observa que los 3 hermanos presentan la mutación primaria 11778 en homoplasmia, aunque sólo los varones están afectados de atrofia óptica.
En la familia 2, con la mutación 14484, el sujeto índice es III2. Todos los individuos portadores de mutación son homoplásmicos, salvo II2, III2 y III4 (fig. 2). Únicamente el individuo II1 es normal () para la mutación. El individuo II5, además de presentar la mutación primaria 14484, tiene la intermedia 15257. Pese a esto, hasta el momento no muestra ninguna afectación ocular. En la familia 3, la sujeto índice I2 presenta dos sustituciones: la 14484 y la 15257, ambas en homoplasmia. El estudio posterior del ADNmt de sus 2 hijos, que no han desarrollado pérdida visual hasta el momento del estudio, ha mostrado que ambos han heredado en homoplasmia estas mismas mutaciones.
Discusión
Antes de que el análisis del ADNmt fuese posible, el diagnóstico de LHON se basaba en el cuadro clínico, la historia familiar y la exclusión de otras causas de neuropatía óptica. Desde la introducción de las técnicas de biología molecular, estos criterios han sido considerados poco específicos por algunos autores, propugnando un diagnóstico basado en la combinación de los estudios clínicos y moleculares13.
El hecho de no haber encontrado ninguna de las mutaciones analizadas en el 67,75% de los individuos de nuestro estudio podría explicarse por la existencia de algún gen nuclear que pudiese estar implicado en la LHON, o bien por otras mutaciones en el ADNmt aún no descritas. Sin embargo, el único dato a favor de la primera hipótesis, y a raíz de la mayor incidencia en los varones que en las mujeres, fue publicado por Bu y Rotter14, proponiendo la existencia de un gen en el cromosoma X responsable del fenotipo LHON. Esto fue posteriormente descartado por Sweeney et al15.
Dado que este grupo de pacientes sin ninguna mutación cumple los criterios clínicos de la LHON y son éstos los que, hasta el momento, definen la enfermedad, creemos que podría existir alguna otra mutación con el ADNmt de estas personas diferente a las analizadas o incluso no descrita reponsable del fenotipo LHON.
El análisis de las 3 familias estudiadas permite abordar algunas de las características más llamativas de esta neuropatía.
En los tres hermanos de la familia 1 se ha detectado en homoplasmia la mutación primaria 11778, que es la predominante entre los casos de Leber, tanto europeos (> 50%) como mundiales (el 95% entre asiáticos). Se considera la mutación LHON más grave, pues la probabilidad de recuperación visual para los pacientes que la presentan es, en general, mucho menor que para el caso de otras mutaciones16. Esta mutación G11778A sustituye una arginina por una histidina en la subunidad ND4 del complejo I de la cadena respiratoria. El hecho de que esta arginina esté altamente conservada en especies muy variadas y distantes evolutivamente indica que este residuo tiene un papel funcional o estructural importante. Su sustitución por histidina podría interrumpir la función de la CRM11.
La mujer II1 tiene la mutación en homoplasmia, al igual que sus hermanos, y no tiene problema visual alguno. Esta diferencia en la expresividad de la enfermedad entre los varones y las mujeres es muy frecuente en las familias con LHON. Se ha propuesto que la expresión de las mutaciones en el ADNmt podría estar modulada por factores de codificación nuclear, dado que varios aspectos de la herencia de la enfermedad (p. ej., la predominancia en los varones, la reducida penetrancia y la edad de inicio avanzada en las mujeres) no pueden ser explicados tan sólo considerando la herencia mitocondrial14,15. En la familia 2 se ha detectado la mutación 14484 y se ha podido seguir su herencia a lo largo de tres generaciones. En la primera generación, el hermano de la abuela (I3) presenta la mutación en homoplasmia. Si bien sufrió una pérdida de agudeza visual a los 30 años, la ha ido recuperando lentamente. Éste es un fenómeno que ha sido descrito con anterioridad en múltiples ocasiones y que permite considerar a esta mutación como la primaria de mejor pronóstico7. Dado que II2, II3 y II5 también la presentan, no hay duda de que I2 es portadora de dicha mutación. Únicamente, II2 es heteroplásmica para la misma en esta generación, mientras que II3 y II5 son homoplásmicos y, sin embargo, el examen oftalmológico no detectó ninguna anomalía. En la tercera generación, todos los individuos tienen la mutación 14484: III1 y III3 en homoplasmia, y III2 y III4 en heteroplasmia. Sólo III2 tiene una agudeza visual de 0,05 y un escotoma central en ambos ojos. Su hermana III1 y su primo III3 no poseen anomalía visual alguna. En cambio, III4, a pesar de manifestarse asintomático, presenta una agudeza visual disminuida en ambos ojos y un test cromático con alteraciones respecto al patrón de visión normal.
La mutación primaria 14484 consiste en la sustitución de una metionina débilmente conservada por una valina en la subunidad ND6 del complejo I. Se ha visto asociada con frecuencia a otras mutaciones LHON secundarias17, lo que dificulta el esclarecimiento de su papel en la etiología de la enfermedad. Esto, junto con la baja conservación del residuo de metionina a lo largo de la escala evolutiva, cuestiona el papel de esta mutación como primaria. A favor de su papel patogénico está el hecho de que no ha sido detectada en ningún control normal y de que se han descrito pacientes con la neuropatía característica que presentan esta mutación 14484 como única mutación Leber.
El diferente grado de heteroplasmia es uno de los factores sugeridos como responsable de la variabilidad en la gravedad de la pérdida visual entre los individuos de una misma familia18,19. No obstante, probablemente no justifica más que una pequeña parte de tal variabilidad y, en todo caso, no explicaría por qué los individuos heteroplásmicos presentan en ocasiones más sintomatología que los homoplásmicos. Se ha postulado la participación de factores epigénicos como posibles moduladores de la expresión fenotípica de la enfermedad, tales como tóxicos ambientales20 o fenómenos de autoinmunidad1. Otro posible factor contribuyente sería la asociación con otras mutaciones Leber. Por ejemplo, II5 presenta además el cambio G15257A. El papel de esta mutación en la patogenia de la LHON ha sido muy discutido. Dicha mutación se ha encontrado en un 0,3% de los controles normales2 y muy frecuentemente asociada con otras, tales como G13708A y T14484C21,22.
Finalmente, hay que considerar que el porcentaje de moléculas mutadas en el tejido estudiado, en este caso linfocitos, puede no corresponderse con la proporción existente en los tejidos afectados, el nervio óptico y la retina. Es posible que en dichos tejidos el porcentaje de mitocondrias mutadas sea mayor para los individuos más severamente afectados. Recientemente se ha descrito el caso de dos gemelos monozigóticos heteroplásmicos para la mutación 14484. Sólo uno de ellos presentaba clínica de LHON. El otro, no afectado, era sin embargo el que tenía un mayor número de moléculas de ADNmt mutadas23.
En la familia 3 se plantea una nueva cuestión: el consejo genético en la LHON. El sujeto I2 presentaba dos mutaciones en su ADNmt: 15257 y 14484. Existía la posibilidad de que las hubiese transmitido a su descendencia. Se completó el examen genético para sus hijos clínicamente asintomáticos, resultando también portadores de las dos mutaciones. El hijo (II2) no transmitirá las mutaciones a su progenie, pero la hermana (II1) podría hacerlo. La transmisión de la mutación no está siempre asociada a la transmisión de la enfermedad, pues la cantidad de mitocondrias que contienen moléculas mutadas necesaria para provocar el fenotipo Leber puede ser muy variable de persona a persona. Además, el número de mitocondrias por célula varía en función de los requerimientos energéticos de cada tejido. Por ello, los resultados obtenidos en la sangre pueden no reflejar la situación en los oocitos. Todo esto dificulta el consejo genético y cuestiona la posibilidad de ofrecer un diagnóstico prenatal para esta enfermedad.
El análisis molecular ha ayudado enormemente a clarificar el diagnóstico de muchos pacientes con enfermedad de Leber. Creemos, sin embargo, que este tipo de estudio debería sólo realizarse en los individuos seleccionados tras un examen oftalmológico exhaustivo. A pesar de que hace ya 10 años que se pudo demostrar que la LHON era una enfermedad de origen mitocondrial3, siguen existiendo todavía muchas cuestiones sin respuesta. Las peculiaridades de la herencia mitocondrial probablemente contribuyen a esta complejidad.
Agradecimiento
Agradecemos a los pacientes y los familiares incluidos en este estudio su amable participación. Este trabajo ha sido financiado en parte por la CICYT (SAF96-0227) y CICYT (SAF95-191). Virginia Nunes y Xavier Estivill están financiados por el Institut Català de la Salut.
Bibliografía1.
Harding AE, Sweeney MG Leber's hereditary optic neuropathy. En: Shapira AHV, DiMauro S, editores. Mitochondrial disorders in neurology. Oxford: Butterworth-Heinemann Ltd., 1994; 181-198.2. Brown MD, Voljavec AS, Lott MT, McDonald I, Wallace DC Leber's hereditary optic neuropathy: a model for mitochondrial neurodegenerative diseases. FASEB J 1992; 6: 2.791-2.799.[Medline]3. Wallace DC, Singh G, Lott MT, Hodge JA, Schurr TG, Lezza AMS et al Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science 1988; 242: 1.427-1.430.[Medline]4. Wallace DC Diseases of the mitochondrial DNA. Annu Rev Biochem 1992; 61: 1.175-1.212.[Medline]5. Jacobson DM, Stone EM Difficulty differentiating Leber's from dominant optic neuropathy in a patient with remote visual loss. J Clin Neuroophthalmol 1991; 11: 152-157.[Medline]6. Borruat F-X, Green WT, Graham EM, Sweeney MG, Morgan-Hugues JA, Sanders MD Late onset Leber's optic neuropathy: a case confused with ischaemic optic neuropathy. Br J Ophthalmol 1992; 76: 571-573.[Medline]7. Riordan-Eva P, Harding AE Leber's hereditary optic neuropathy: the clinical relevance of different mitochondrial DNA mutations. J Med Genet 1995; 32: 81-87.[Medline]8. Johns DR, Neufeld MJ Cytochrome c oxidase mutations in Leber hereditary optic neuropathy. Biochem Biophys Res Commun 1991; 196: 810-815.[Medline]9. Huoponen K, Lamminen T, Juvonen V, Aula P, Nikoskelainen E, Savontaus JL The spectrum of mitochondrial DNA mutations in families with Leber hereditary optic neuroretinopathy. Human Genetics 1993; 92: 379-384.[Medline]10. Domènech JM Bioestadística: métodos estadísticos para investigadores. Barcelona: Herder, 1982; 163-165.11. Howell N Primary LHON mutations: trying to separate «fruyt» from «chaf». Clin Neurosci 1994; 2: 130-137.12. Hofmann S, Bezold R, Jaksch M, Obermaier-Kusser B, Mertens S, Kaufhold P et al Wolfram (DIDMOAD) Syndrome and Leber hereditary neuropathy (LHON) are associated with distinct mitochondrial DNA haplotypes. Genomics 1977; 39: 8-18.[Medline]13. Oostra RJ, Tijmes NT, Cobben JM, Bolhuis PA, Van Nesselrooij BPM, Houtman WA et al On the many faces of Leber hereditary optic neuropathy. Clin Genet 1997; 51: 388-393.[Medline]14. Bu X, Rotter JI X chromosome-linked and mitochondrial gene control of Leber hereditary optic neuropathy: evidence from segregation analy- sis for dependence on X chromosome inacti- vation. Proc Nat Acad Sci 1991; 88: 8.198-8.202.15. Sweeney MG, Davis MB, Lashwood A, Brockington M, Toscano A, Harding AE Evidence against an X-linked locus close to DXS7 determining visual loss susceptibility in British and Italian families with Leber hereditary optic neuropathy. Am J Hum Genet 1992; 51: 741-748.[Medline]16. McKusick VA Mendelian inheritance in man (10.a ed.). Baltimore: Johns Hopkins University Press, 1992; 1.893-1.895.17. Johns DR, Berman J Alternative, simultaneous complex I mitochondrial DNA mutations in Leber's hereditary optic neuropathy. Biochem Biophys Res Commun 1991; 174: 1.324-1.330.[Medline]18. Smith KH, Johns DR, Heher KL, Miller NR Heteroplasmy in Leber's hereditary optic neuropathy. Arch Ophthalmol 1993; 111: 1.486-1.490.[Medline]19. Holt IJ, Miller DH, Harding AE Genetic heterogeneity and mitochondrial DNA heteroplasmy in Leber's hereditary optic neuropathy. J Med Genet 1989; 26: 739-743.[Medline]20. Cullom ME, Heher KL, Miller MR, Savino PJ, Johns Dr Leber's hereditary optic neuropathy masquerading as tobacco-alcohol amblyopia. Arch Ophtalmol 1993; 111: 1.482-1.485.21. Wallace DC, Brown MD, Lott MT, Voljavec AS, Torroni A, Yang CC Multiple mitochondrial DNA mutations associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Cytogenet Cell Genet 1991; 58: 2.121.22. Johns DR, Heher KL, Miller NR, Smith KH Leber's hereditary optic neuropathy. Clinical manifestations of the 14484 mutation. Arch Ophthalmol 1993; 111: 495-498.[Medline]23. Biousse V, Brown MD, Newman NJ, Allen JC, Rosenfeld J, Meola G et al De novo 14484 mitochondrial DNA mutation in monozygotic twins discordant for Leber's optic neuropathy. Neurology 1997; 49: 1.136-1.138.[Medline]24. Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, DeBruijn MHL, Coulson AR, Drouin J et al Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature (Lond) 1981; 290: 457-465.25. Yuzaki M, Ohkoshi N, Kanazawa I, Kagawa Y, Ohta S Multiple deletions in mitochondrial DNA at direct repeats of non-D-loop regions in cases of familial mitochondrial myopathy. Biochem Biophys Res Commun 1989; 164: 1.352-1.357[Medline]
Por Montserrat Gómez Zaera a, Antoni Barrientosa a, Luis Arias b, Isabel Rojas a, Jordi Arruga b, Xavier Estivill a, Jordi Casademont c, Virginia Nunes a
a Centre de Genètica Mèdica i Molecular. IRO. Hospital Duran i Reynals. Barcelona.
b Servei d'Oftalmologia. Hospital de Bellvitge.
c Grup d'Investigació Muscular. Servei de Medicina Interna General. Hospital Clínic. Universitat de Barcelona.
Fundamento:
La atrofia óptica de Leber (AOL) es una enfermedad de origen mitocondrial. Representa la causa más frecuente de incapacidad visual en varones jóvenes que no presentan otra enfermedad. Pacientes y métodos:Se han analizado mutaciones Leber en 31 individuos españoles aquejados de atrofia óptica que cumplen los criterios clínicos de AOL. Se han estudiado las 3 mutaciones primarias y algunas secundarias, y se han comparado sus frecuencias con las de otras series mundiales. También se ha analizado la segregación de la enfermedad y las mutaciones asociadas a ella en cinco grupos familiares. La detección de las mutaciones puntuales se ha efectuado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), seguida de digestión con enzimas de restricción y posterior separación electroforética.
Resultados:
El 67,75% de los pacientes no presenta ninguna de las mutaciones analizadas, el 16,13% presenta una, y el restante 16,13% tiene dos mutaciones Leber. Las tres mutaciones primarias y la 15257 son las que se han detectado en una mayor frecuencia (30% cada una). No existen diferencias estadísticamente significativas entre las tasas de mutaciones primarias de los pacientes de esta serie y los de otras poblaciones. Las diferencias son significativas para la mutación 15257. Conclusiones:La muestra de la población española estudiada no se diferencia de otras poblaciones caucásicas en lo que respecta a las principales mutaciones Leber. La transmisión de dichas mutaciones a la descendencia no implica la transmisión de la enfermedad, lo que dificulta el consejo genético y hace prácticamente inviable el diagnóstico prenatal para esta enfermedad
Med Clin (Barc). 1999;112:326-9.
La atrofia óptica de Leber, también conocida como LHON (Leber's hereditary optic neuropathy), es una enfermedad hereditaria, de transmisión materna, que se presenta normalmente en la segunda o tercera décadas de la vida como una pérdida de visión central de la retina indolora, aguda o subaguda. La afectación de ambos ojos ocurre de forma simultánea o sucesiva. Es la causa más frecuente de incapacidad visual en varones jóvenes del mundo occidental que no presentan otras enfermedades1. En la población de origen caucásico predomina la afectación en los varones (relación varón:mujer = 4:1)2.
La LHON fue la primera enfermedad que pudo asociarse a mutaciones puntuales en el ADN mitocondrial (ADNmt)3. Las mitocondrias contienen 2-10 moléculas de ADN, y en una misma mitocondria pueden coexistir moléculas de ADN normales y mutadas (heteroplasmia), en contraposición a la situación de homoplasmia, en la que existe una sola población de genomas mitocondriales.
Las mutaciones LHON se clasifican en primarias y secundarias. Las primarias (G11778A, G3460A y T14484C) son causa suficiente para provocar LHON por sí mismas y no se detectan en controles normales. Las secundarias, presentes también en controles normales4, aparecen junto con otras mutaciones primarias o secundarias, y se asume que actuarían sinergísticamente en el desarrollo de la enfermedad.
En el presente trabajo se resume nuestra experiencia en el diagnóstico de la atrofia óptica de Leber en la población española. Se describen las mutaciones presentes en 31 individuos independientes estudiados, se compara su frecuencia con otras series europeas o mundiales, y se analiza la segregación de la enfermedad y de las mutaciones asociadas a ella en cinco genealogías. Finalmente, se discute el interés del análisis molecular para establecer el diagnóstico diferencial con otras entidades causantes de pérdida de visión, tales como las neuropatías ópticas dominantes5, isquémica anterior6, tóxicas o desmielinizantes.
Pacientes y métodos
Pacientes
Se seleccionaron individuos que acudieron a la Consulta de Oftalmología del Hospital de Bellvitge y que presentaban las siguientes características: a) pérdida de visión central indolora, aguda o subaguda; b) afectación bilateral de forma simultánea o secuencial, y c) existencia de telangiectasias peripapilares y discreto borramiento e hiperemia del disco óptico en fases iniciales con evolución hacia la atrofia óptica.
De todos los pacientes se obtuvo una historia clínica detallada que incluyó antecedentes familiares, hábitos tóxicos y un examen oftalmológico completo al que se añadieron el test cromático de Ishihara y una campimetría computarizada. Adicionalmente, se realizaron unos potenciales evocados visuales y una resonancia magnética (RM) cerebral.
Métodos
Se procedió a la extracción de ADN total a partir de 15 ml de sangre periférica, siguiendo procedimientos estándar basados en una purificación con fenol-cloroformo y en una precipitación con etanol. El ADN se cuantificó por espectrofotometría registrando la absorbancia a 260 nm. Mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se amplificaron regiones del ADNmt que incluían la posición nucleotídica de las mutaciones a estudiar. Se analizaron las mutaciones primarias 11778, 3460 y 14484, todas ellas localizadas en la región que codifica para la subunidad 1 del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial (CRM), responsables de más del 90% de los casos de atrofia óptica de Leber descritos7. También se incluyó en nuestro trabajo la mutación 15257, localizada en el gen citocromo b, inicialmente considerada primaria8, y más recientemente intermedia (de más importancia clínica que las secundarias) o incluso secundaria7. Finalmente se analizaron las secundarias 15812 en el gen del citocromo b2 y la 4732, localizada en el gen de la sub-unidad 2 del complejo I9. Para cada una de las reacciones de amplificación se utilizaron 200 ng de ADN, la pareja de oligonucleótidos adecuada (tabla 1) a una concentración final de 0,8 µ M y 200 µ M de dNTPs (desoxinucleótidos fosfato). El resto de componentes los proporcionó el kit de PCR de Boehringer-Mannheim: 1,5 U de Taq-ADN polimerasa, 10 mM de Tris-HCl, 1,5 mM de MgCl2 y 50 mM de KCl. Tras las amplificaciones se procedió a la digestión de los productos de PCR con enzimas de restricción para determinar, dependiendo de cada mutación, la ganancia o pérdida de dianas específicas que producen polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Así, cuando una de estas mutaciones ocurre, se produce un cambio en una diana de restricción: bien desapareciendo una existente en el ADNmt salvaje, bien apareciendo una nueva. La tabla 1 ilustra la zona amplificada para cada mutación, la enzima utilizada y los fragmentos esperados tras la digestión. Dichos fragmentos se separaron electroforéticamente en geles de acrilamida al 5% y se tiñeron en bromuro de etidio para su posterior visualización bajo luz ultravioleta.
Para comparar la proporción de cada una de las mutaciones halladas en nuestros pacientes con la descrita en la bibliografía, se utilizó una prueba basada en el cálculo exacto de significación según la ley binomial10 del paquete estadístico SPSS.
Resultados
Inicialmente, se obtuvieron linfocitos de la sangre periférica de 31 individuos independientes. Para cinco de éstos se pudo disponer de sangre de familiares directos, lo que permitió un estudio más completo de la transmisión de las mutaciones Leber en la familia. Todos los individuos que cumplían los criterios clínicos de LHON y para los que se descartó otra enfermedad que justificase la pérdida de agudeza visual fueron incluidos en el presente estudio genético. El total de muestras analizadas, sumando los familiares disponibles, fue de 49. El rango de edad de los pacientes abarcaba de los 14 a los 55 años y el 78% eran varones. El período de evolución de la pérdida de visión en el momento del diagnóstico oscilaba entre las 3 semanas y los 12 meses. La agudeza visual de los pacientes en la primera visita variaba desde la percepción de luz hasta 0,4 según la escala de Wecker, y todos ellos mostraron un test cromático alterado. El campo visual presentó un escotoma central o centrocecal y los potenciales evocados visuales evidenciaron un retraso en el tiempo de latencia y una disminución en la amplitud de las ondas en todos los casos. La RM fue normal también en todos ellos, excepto en uno en el que al aplicar secuencias de supresión de grasa se detectó un aumento de señal en ambos nervios ópticos.
En la figura 1, se puede observar el fondo de ojo característico de un paciente con LHON (III2 de la familia 2; fig. 2).
La distribución de las mutaciones Leber en el grupo estudiado es la siguiente: en 21 personas (67,75%) no se halló ninguna de las mutaciones analizadas; cinco (16,13%) presentaban una única mutación, y otras cinco, dos mutaciones en su ADNmt (tabla 2).
Al comparar la tasa de mutaciones primarias en nuestros pacientes con las de otros estudios en la población con mutaciones Leber no española, observamos pocas diferencias: entre nuestra población se da en una menor frecuencia la mutación 11778 (el 30% frente a más de un 50%, p = 0,34, NS)11, mientras que la frecuencia de las otras mutaciones primarias es muy parecida (el 30% de la mutación 3460 frente a un 20-25%, p = 0,47, NS, y el 30% de la 14484, frente a algo menos del 20%, p = 0,32, NS)11,12. Por el contrario, la proporción de nuestros pacientes con la mutación 15257 (30%) prácticamente dobla la observada en otros países (alrededor del 15%, p = 0,0004)12.
Grupos familiares estudiados
En 3 de las 5 familias disponibles se detectó alguna mutación Leber. Las genealogías de estas 3 familias se detallan en la figura 2, junto con las mutaciones presentes en el ADNmt de cada individuo. En la familia 1, se observa que los 3 hermanos presentan la mutación primaria 11778 en homoplasmia, aunque sólo los varones están afectados de atrofia óptica.
En la familia 2, con la mutación 14484, el sujeto índice es III2. Todos los individuos portadores de mutación son homoplásmicos, salvo II2, III2 y III4 (fig. 2). Únicamente el individuo II1 es normal () para la mutación. El individuo II5, además de presentar la mutación primaria 14484, tiene la intermedia 15257. Pese a esto, hasta el momento no muestra ninguna afectación ocular. En la familia 3, la sujeto índice I2 presenta dos sustituciones: la 14484 y la 15257, ambas en homoplasmia. El estudio posterior del ADNmt de sus 2 hijos, que no han desarrollado pérdida visual hasta el momento del estudio, ha mostrado que ambos han heredado en homoplasmia estas mismas mutaciones.
Discusión
Antes de que el análisis del ADNmt fuese posible, el diagnóstico de LHON se basaba en el cuadro clínico, la historia familiar y la exclusión de otras causas de neuropatía óptica. Desde la introducción de las técnicas de biología molecular, estos criterios han sido considerados poco específicos por algunos autores, propugnando un diagnóstico basado en la combinación de los estudios clínicos y moleculares13.
El hecho de no haber encontrado ninguna de las mutaciones analizadas en el 67,75% de los individuos de nuestro estudio podría explicarse por la existencia de algún gen nuclear que pudiese estar implicado en la LHON, o bien por otras mutaciones en el ADNmt aún no descritas. Sin embargo, el único dato a favor de la primera hipótesis, y a raíz de la mayor incidencia en los varones que en las mujeres, fue publicado por Bu y Rotter14, proponiendo la existencia de un gen en el cromosoma X responsable del fenotipo LHON. Esto fue posteriormente descartado por Sweeney et al15.
Dado que este grupo de pacientes sin ninguna mutación cumple los criterios clínicos de la LHON y son éstos los que, hasta el momento, definen la enfermedad, creemos que podría existir alguna otra mutación con el ADNmt de estas personas diferente a las analizadas o incluso no descrita reponsable del fenotipo LHON.
El análisis de las 3 familias estudiadas permite abordar algunas de las características más llamativas de esta neuropatía.
En los tres hermanos de la familia 1 se ha detectado en homoplasmia la mutación primaria 11778, que es la predominante entre los casos de Leber, tanto europeos (> 50%) como mundiales (el 95% entre asiáticos). Se considera la mutación LHON más grave, pues la probabilidad de recuperación visual para los pacientes que la presentan es, en general, mucho menor que para el caso de otras mutaciones16. Esta mutación G11778A sustituye una arginina por una histidina en la subunidad ND4 del complejo I de la cadena respiratoria. El hecho de que esta arginina esté altamente conservada en especies muy variadas y distantes evolutivamente indica que este residuo tiene un papel funcional o estructural importante. Su sustitución por histidina podría interrumpir la función de la CRM11.
La mujer II1 tiene la mutación en homoplasmia, al igual que sus hermanos, y no tiene problema visual alguno. Esta diferencia en la expresividad de la enfermedad entre los varones y las mujeres es muy frecuente en las familias con LHON. Se ha propuesto que la expresión de las mutaciones en el ADNmt podría estar modulada por factores de codificación nuclear, dado que varios aspectos de la herencia de la enfermedad (p. ej., la predominancia en los varones, la reducida penetrancia y la edad de inicio avanzada en las mujeres) no pueden ser explicados tan sólo considerando la herencia mitocondrial14,15. En la familia 2 se ha detectado la mutación 14484 y se ha podido seguir su herencia a lo largo de tres generaciones. En la primera generación, el hermano de la abuela (I3) presenta la mutación en homoplasmia. Si bien sufrió una pérdida de agudeza visual a los 30 años, la ha ido recuperando lentamente. Éste es un fenómeno que ha sido descrito con anterioridad en múltiples ocasiones y que permite considerar a esta mutación como la primaria de mejor pronóstico7. Dado que II2, II3 y II5 también la presentan, no hay duda de que I2 es portadora de dicha mutación. Únicamente, II2 es heteroplásmica para la misma en esta generación, mientras que II3 y II5 son homoplásmicos y, sin embargo, el examen oftalmológico no detectó ninguna anomalía. En la tercera generación, todos los individuos tienen la mutación 14484: III1 y III3 en homoplasmia, y III2 y III4 en heteroplasmia. Sólo III2 tiene una agudeza visual de 0,05 y un escotoma central en ambos ojos. Su hermana III1 y su primo III3 no poseen anomalía visual alguna. En cambio, III4, a pesar de manifestarse asintomático, presenta una agudeza visual disminuida en ambos ojos y un test cromático con alteraciones respecto al patrón de visión normal.
La mutación primaria 14484 consiste en la sustitución de una metionina débilmente conservada por una valina en la subunidad ND6 del complejo I. Se ha visto asociada con frecuencia a otras mutaciones LHON secundarias17, lo que dificulta el esclarecimiento de su papel en la etiología de la enfermedad. Esto, junto con la baja conservación del residuo de metionina a lo largo de la escala evolutiva, cuestiona el papel de esta mutación como primaria. A favor de su papel patogénico está el hecho de que no ha sido detectada en ningún control normal y de que se han descrito pacientes con la neuropatía característica que presentan esta mutación 14484 como única mutación Leber.
El diferente grado de heteroplasmia es uno de los factores sugeridos como responsable de la variabilidad en la gravedad de la pérdida visual entre los individuos de una misma familia18,19. No obstante, probablemente no justifica más que una pequeña parte de tal variabilidad y, en todo caso, no explicaría por qué los individuos heteroplásmicos presentan en ocasiones más sintomatología que los homoplásmicos. Se ha postulado la participación de factores epigénicos como posibles moduladores de la expresión fenotípica de la enfermedad, tales como tóxicos ambientales20 o fenómenos de autoinmunidad1. Otro posible factor contribuyente sería la asociación con otras mutaciones Leber. Por ejemplo, II5 presenta además el cambio G15257A. El papel de esta mutación en la patogenia de la LHON ha sido muy discutido. Dicha mutación se ha encontrado en un 0,3% de los controles normales2 y muy frecuentemente asociada con otras, tales como G13708A y T14484C21,22.
Finalmente, hay que considerar que el porcentaje de moléculas mutadas en el tejido estudiado, en este caso linfocitos, puede no corresponderse con la proporción existente en los tejidos afectados, el nervio óptico y la retina. Es posible que en dichos tejidos el porcentaje de mitocondrias mutadas sea mayor para los individuos más severamente afectados. Recientemente se ha descrito el caso de dos gemelos monozigóticos heteroplásmicos para la mutación 14484. Sólo uno de ellos presentaba clínica de LHON. El otro, no afectado, era sin embargo el que tenía un mayor número de moléculas de ADNmt mutadas23.
En la familia 3 se plantea una nueva cuestión: el consejo genético en la LHON. El sujeto I2 presentaba dos mutaciones en su ADNmt: 15257 y 14484. Existía la posibilidad de que las hubiese transmitido a su descendencia. Se completó el examen genético para sus hijos clínicamente asintomáticos, resultando también portadores de las dos mutaciones. El hijo (II2) no transmitirá las mutaciones a su progenie, pero la hermana (II1) podría hacerlo. La transmisión de la mutación no está siempre asociada a la transmisión de la enfermedad, pues la cantidad de mitocondrias que contienen moléculas mutadas necesaria para provocar el fenotipo Leber puede ser muy variable de persona a persona. Además, el número de mitocondrias por célula varía en función de los requerimientos energéticos de cada tejido. Por ello, los resultados obtenidos en la sangre pueden no reflejar la situación en los oocitos. Todo esto dificulta el consejo genético y cuestiona la posibilidad de ofrecer un diagnóstico prenatal para esta enfermedad.
El análisis molecular ha ayudado enormemente a clarificar el diagnóstico de muchos pacientes con enfermedad de Leber. Creemos, sin embargo, que este tipo de estudio debería sólo realizarse en los individuos seleccionados tras un examen oftalmológico exhaustivo. A pesar de que hace ya 10 años que se pudo demostrar que la LHON era una enfermedad de origen mitocondrial3, siguen existiendo todavía muchas cuestiones sin respuesta. Las peculiaridades de la herencia mitocondrial probablemente contribuyen a esta complejidad.
Agradecimiento
Agradecemos a los pacientes y los familiares incluidos en este estudio su amable participación. Este trabajo ha sido financiado en parte por la CICYT (SAF96-0227) y CICYT (SAF95-191). Virginia Nunes y Xavier Estivill están financiados por el Institut Català de la Salut.
Bibliografía1.
Harding AE, Sweeney MG Leber's hereditary optic neuropathy. En: Shapira AHV, DiMauro S, editores. Mitochondrial disorders in neurology. Oxford: Butterworth-Heinemann Ltd., 1994; 181-198.2. Brown MD, Voljavec AS, Lott MT, McDonald I, Wallace DC Leber's hereditary optic neuropathy: a model for mitochondrial neurodegenerative diseases. FASEB J 1992; 6: 2.791-2.799.[Medline]3. Wallace DC, Singh G, Lott MT, Hodge JA, Schurr TG, Lezza AMS et al Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science 1988; 242: 1.427-1.430.[Medline]4. Wallace DC Diseases of the mitochondrial DNA. Annu Rev Biochem 1992; 61: 1.175-1.212.[Medline]5. Jacobson DM, Stone EM Difficulty differentiating Leber's from dominant optic neuropathy in a patient with remote visual loss. J Clin Neuroophthalmol 1991; 11: 152-157.[Medline]6. Borruat F-X, Green WT, Graham EM, Sweeney MG, Morgan-Hugues JA, Sanders MD Late onset Leber's optic neuropathy: a case confused with ischaemic optic neuropathy. Br J Ophthalmol 1992; 76: 571-573.[Medline]7. Riordan-Eva P, Harding AE Leber's hereditary optic neuropathy: the clinical relevance of different mitochondrial DNA mutations. J Med Genet 1995; 32: 81-87.[Medline]8. Johns DR, Neufeld MJ Cytochrome c oxidase mutations in Leber hereditary optic neuropathy. Biochem Biophys Res Commun 1991; 196: 810-815.[Medline]9. Huoponen K, Lamminen T, Juvonen V, Aula P, Nikoskelainen E, Savontaus JL The spectrum of mitochondrial DNA mutations in families with Leber hereditary optic neuroretinopathy. Human Genetics 1993; 92: 379-384.[Medline]10. Domènech JM Bioestadística: métodos estadísticos para investigadores. Barcelona: Herder, 1982; 163-165.11. Howell N Primary LHON mutations: trying to separate «fruyt» from «chaf». Clin Neurosci 1994; 2: 130-137.12. Hofmann S, Bezold R, Jaksch M, Obermaier-Kusser B, Mertens S, Kaufhold P et al Wolfram (DIDMOAD) Syndrome and Leber hereditary neuropathy (LHON) are associated with distinct mitochondrial DNA haplotypes. Genomics 1977; 39: 8-18.[Medline]13. Oostra RJ, Tijmes NT, Cobben JM, Bolhuis PA, Van Nesselrooij BPM, Houtman WA et al On the many faces of Leber hereditary optic neuropathy. Clin Genet 1997; 51: 388-393.[Medline]14. Bu X, Rotter JI X chromosome-linked and mitochondrial gene control of Leber hereditary optic neuropathy: evidence from segregation analy- sis for dependence on X chromosome inacti- vation. Proc Nat Acad Sci 1991; 88: 8.198-8.202.15. Sweeney MG, Davis MB, Lashwood A, Brockington M, Toscano A, Harding AE Evidence against an X-linked locus close to DXS7 determining visual loss susceptibility in British and Italian families with Leber hereditary optic neuropathy. Am J Hum Genet 1992; 51: 741-748.[Medline]16. McKusick VA Mendelian inheritance in man (10.a ed.). Baltimore: Johns Hopkins University Press, 1992; 1.893-1.895.17. Johns DR, Berman J Alternative, simultaneous complex I mitochondrial DNA mutations in Leber's hereditary optic neuropathy. Biochem Biophys Res Commun 1991; 174: 1.324-1.330.[Medline]18. Smith KH, Johns DR, Heher KL, Miller NR Heteroplasmy in Leber's hereditary optic neuropathy. Arch Ophthalmol 1993; 111: 1.486-1.490.[Medline]19. Holt IJ, Miller DH, Harding AE Genetic heterogeneity and mitochondrial DNA heteroplasmy in Leber's hereditary optic neuropathy. J Med Genet 1989; 26: 739-743.[Medline]20. Cullom ME, Heher KL, Miller MR, Savino PJ, Johns Dr Leber's hereditary optic neuropathy masquerading as tobacco-alcohol amblyopia. Arch Ophtalmol 1993; 111: 1.482-1.485.21. Wallace DC, Brown MD, Lott MT, Voljavec AS, Torroni A, Yang CC Multiple mitochondrial DNA mutations associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Cytogenet Cell Genet 1991; 58: 2.121.22. Johns DR, Heher KL, Miller NR, Smith KH Leber's hereditary optic neuropathy. Clinical manifestations of the 14484 mutation. Arch Ophthalmol 1993; 111: 495-498.[Medline]23. Biousse V, Brown MD, Newman NJ, Allen JC, Rosenfeld J, Meola G et al De novo 14484 mitochondrial DNA mutation in monozygotic twins discordant for Leber's optic neuropathy. Neurology 1997; 49: 1.136-1.138.[Medline]24. Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, DeBruijn MHL, Coulson AR, Drouin J et al Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature (Lond) 1981; 290: 457-465.25. Yuzaki M, Ohkoshi N, Kanazawa I, Kagawa Y, Ohta S Multiple deletions in mitochondrial DNA at direct repeats of non-D-loop regions in cases of familial mitochondrial myopathy. Biochem Biophys Res Commun 1989; 164: 1.352-1.357[Medline]
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